Бактеріофаги вже понад століття використовуються для лікування інфекційних бактеріальних захворювань. Оскільки інфекції, стійкі до антибіотиків, дедалі більше загрожують громадському здоров’ю, інтерес до бактеріофагів як терапевтичних засобів знову зріс. Проте ця галузь досі значною мірою обмежена природними штамами, адже складні методи їхньої інженерії уповільнюють відкриття та створення індивідуалізованих терапевтичних варіантів.

Тепер дослідники з New England Biolabs (NEB®, Массачусетс, США) та Єльського університету (Коннектикут, США) описали першу повністю синтетичну систему створення бактеріофагів для Pseudomonas aeruginosa — бактерії, стійкої до антибіотиків і важливої у глобальному масштабі. Це дослідження опубліковане в журналі PNAS. Система працює завдяки платформі High-Complexity Golden Gate Assembly (HC-GGA), розробленій NEB.

У цьому методі вчені створюють бактеріофаги синтетично — на основі генетичних послідовностей, а не ізольованих вірусів. Команда зібрала фаг для P. aeruginosa з 28 синтетичних фрагментів і запрограмувала його нові властивості за допомогою точкових мутацій, вставок і видалень ДНК.

Ці модифікації включали:

• заміну генів хвостових волокон для зміни спектра бактерій, які фаг може заражати,

• вставлення флуоресцентних маркерів для спостереження за інфекцією в реальному часі.

«Навіть у найкращих умовах інженерія бактеріофагів була надзвичайно трудомісткою. Дослідники витрачали цілі кар’єри на розробку методів створення конкретних модельних фагів у бактеріях-хазяїнах», — зазначив Енді Сіккема, один із провідних авторів статті та науковий співробітник NEB.

«Цей синтетичний метод забезпечує значний технологічний прорив у простоті, безпеці та швидкості, відкриваючи шлях до нових біологічних відкриттів і створення терапій».

НОВИЙ ПІДХІД ДО ІНЖЕНЕРІЇ БАКТЕРІОФАГІВ

Завдяки платформі Golden Gate Assembly від NEB, вчені можуть створювати повний геном фага поза клітиною, по частинах, використовуючи цифрову генетичну інформацію — і одразу включати всі необхідні зміни.

Геном збирається із синтетичної ДНК і потім вводиться в безпечний лабораторний штам бактерій.

Цей метод усуває давні проблеми:

• більше не потрібно працювати з реальними ізольованими фагами,

• не потрібні спеціалізовані штами бактерій-хазяїв,

• що особливо складно для терапевтичних фагів, які атакують патогени людини.

Крім того, зникає необхідність у:

• тривалому відборі,

• багаторазових редагуваннях, характерних для методів усередині клітини.

На відміну від інших методів складання ДНК, які використовують меншу кількість довших фрагментів, Golden Gate Assembly працює з коротшими сегментами. Це дає переваги:

• менша токсичність для клітин,

• легша підготовка,

• менший ризик помилок.

Метод також менш чутливий до повторюваних ділянок і високого вмісту GC, характерних для багатьох геномів фагів.

Завдяки спрощенню та гнучкості цей підхід суттєво розширює можливості для науковців, які працюють над створенням фагових терапій проти антибіотикорезистентності.

МОЛЕКУЛЯРНІ ІНСТРУМЕНТИ ЗНАХОДЯТЬ СВОЄ ЗАСТОСУВАННЯ

Розробка цього швидкого методу стала можливою завдяки співпраці:

• вчених NEB, які створили інструменти для надійного складання великої кількості фрагментів ДНК,

• і дослідників бактеріофагів з Єльського університету, які побачили потенціал цієї технології.

Спочатку метод оптимізували на модельному фагу Escherichia coli T7. Згодом його почали застосовувати до немодельних фагів, що атакують високостійкі до антибіотиків патогени.

«Моя лабораторія створює “дивні молотки”, а потім шукає відповідні “цвяхи”», — підсумував Грег Ломан, старший науковий співробітник NEB і співавтор дослідження.

«У цьому випадку спільнота фаготерапії сказала нам: “Це саме той молоток, на який ми чекали”».

Джерело: https://www.biotechniques.com/drug-discovery-development/the-first-fully-synthetic-bacteriophage-engineering-system-for-pseudomonas-aeruginosa/